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                晋城冰箱价格联盟

                突发!除夕爆发事件!蒙面枪手扫射人群,美国高中!近70人死伤!警方出动坦克!场面如同战争!

                楼主:主力资金 时间:2021-11-22 11:09:07

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                突发!

                当地时间2月14日下午2点,

                美国佛罗里达州Parkland市

                Stoneman Douglas高中

                发生校园枪击案!


                截止本文发稿为止,

                枪击案导致17人死亡!

                至少50人受伤!

                伤亡人数还在不断上升...


                案发两小时后,凶手被警方逮捕!



                现场一片慌乱,非常血腥...


                开枪发生在2.25左右,据教室内的监控视频显示,枪手接连进入不同的教室,没▼有特定目标,随机开枪。


                视频▽中的枪声连续响起,学生们尽量藏在桌子下面,教室角落里...


                摘 ?要 生物监测是环境监测重要部分,当前我国环境监测主要依赖化学分析监测,近年来虽然国际上生物监测『技术发展比较迅猛,但基于我国环境监测标准限制,我国生物监测发展一直处于研究阶段,当前生物监测主要依赖于藻、溞和鱼类水生生物物种同条件下的表达改变水平。对于非模式生物,因为缺乏相关基因组信息,其遗传育种,生命特征等研究进展缓慢,传统的cDNA克隆,基因芯片技术耗时长,效率低,已经无法满足高速发展的生物信息学技术。 1.3.2 转录组测序技术 随着测序技术的发展,第二代测序技术成为很好解决非模式生物基因信息学的一个工具,与传统基因芯片,克隆技术相比,不用知晓基因片段信息。转录组测序技术检测转录本的精确度达到单核核苷酸水平,不仅可以分析基因表达水平和转录本的序列,而且能检测稀有转录本和未知序列,提供丰富的∑ 转录组信息,为我们认识真核生物转录组信息提供了快速,高效,精确的测序技术。目前,已有人类细胞[38],老鼠[39],斑马鱼[40],河蚬[41],拟南芥[42],啤酒酵母[43]进行了转录组测序和㊣分析,为在基因水平研究这些物种提供了生物信息学基础。 目前,二代测序平台主要有三个,如ABI公司的(AB SOLiD)、Illumina 公司(Genome Analyzer II) 和Roche 公司(454 GS-FLX),后来,单分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术由Helicos Biosciences 公司推出。一个重要特点就是高通量,数以千万计的reads被测序。下表列举了这三个平台的异同点。 表1-1 几种测序平台优缺点 测序平台 Illumina/Solexa GA IIx ABI/SOLiD SOLiD3 Roche/454 GS FLX Helicos HeliScope 测序原理 可逆染料终 结合成测序 连接测序 焦磷酸合成 测序 单分子合成 测序 平均读长(bp) 100 35 400~700 21~35 运行时间(d/run) 3~10 7 0.5 5 美元/Mb碱基 0.05 0.15 15 1 主要错误类型 替换 替换 缺失与插入 缺失 准确率 ≧98.5% ≧99.94% ≧99.9% ≧99% 优点 性价比高 准确率最高 运行速度快,读长最长 产量高 缺点 读长短 运行时间长,读长短 错误率高,性价比低 错误率高 本论文以Illumina公司的Hiseq2000测序平台为例,转录组测序技术测序流程主要包括[44, 45]:1、RNA样品准备与质量控制;2、mRNA的纯化与︽片段化;3、cDNA文库第一链的合成;4、cDNA文库第二链的合成;5、末端修复与加A;6、PCR扩增;7、琼脂糖凝胶的纯化;8、cDNA库的质量控制;9、簇生成;10、上机测序并分析。流程图如下: 图1-1 Illumina Hiseq2000测序平台流程图 转录组测序结▼果数据量巨大,往往需要使用专业的生物信息学分析,对测序得到的原始 reads(双端序列)进行质量评估和过滤后,将高质量的 reads 进行转录本的组装,对转录本进行结构注释和功能注释。把 clean reads 回帖到参考序列上,再基于回帖结果进行表达量分析、差异表ω 达基因功能注释等高级分析。一般主流的比对数据库有:美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI),欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute, EMBI),COG(Clusters of Orthologous Groups)蛋白数据库,KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes database)数据库。数据分析流程图如下: 图1-2 测序数据分析流程图 1.3.3 转录组测序技术在环境毒理学上的应用 目前在环境毒◎理学上转录组测序技术有两个方面的主要作用:分子标记物◎的筛选与鉴定;环境中不同污染物对水生生物的毒理学效应和机制。Huang等[46]分析了全氟辛烷磺酸(PFOS)暴露后的青鳉转录组数据,发现青鳉蛋白和脂肪代谢,线粒体功能和神经系统等通路受到了影响;陈辉辉等[41]在2013年报道了氟西汀暴露后河蚬的转录组数据分析结果,鉴定了9383个差异转录本,发现氟西汀的主要影响河蚬的ABC跨膜蛋白,谷胱甘肽代谢,类固醇合成代谢和细胞自噬作用的通路。总之,转录组测序技术在环境毒理学研究中具有很大优势,不仅可以获取受试生物高通量生物学信息,还能鉴定差异转录本,深入研究环境污染物的毒性效应和机制。 1.4神经肽与生物标志物 1.4.1 神经肽定义,分类与功能 神经肽是一系列不同类的细胞信号分子,由神经元细胞通过调控分泌通路产生和释放[47]。它们在功能上起到神经激素,神经递质和神经调质的作用。作为神经活动的调质,神经肽将神经信号在上↓下游神经元细胞间传递[48]。神经肽还可以作为激素经由神经器官的网络释放到血淋巴中在调节各种生理状态,包括生长、代谢和繁殖[49],例如脑啡肽作∩为神经递质在脑参与外围活动包括免疫细胞功能的调节[50, 51]。 第一个神经肽P物质是在上个世纪早期发现,首先从马的大脑和肠道中粗略的提取出来,并且发现它具有强力的降血压和缓解肌肉收缩的作用[52, 53]。对神经肽严肃而专注的研究已经超过30年,大量的神经肽和它们的家族已经在脊椎和无脊椎动物中鉴定出来,如人,老鼠,猪和章鱼,这些研究对理解它们的功能和特征起到了很大的作用[54]。目前神经肽按家族可以分为:速激肽、下丘脑神经肽、垂体后叶激素、内阿片肽、高血糖素相关肽、神经肽Y记忆家族、内皮素家族、心房肽家族以及铃蟾样肽家族[55]。在无脊椎生物中,许多神经肽也被发掘出来,有抗菌肽、阿片肽的干扰效应也未知。淡水双壳软体动物(例如河蚬)的神经肽研究目前也没有报道,急需进行生物标志物的开发。 1.5 有机磷酸酯◤ 1.5.1 有机磷酸酯介绍◥ 自从一些溴代阻燃剂被禁用以来,有机磷酸酯(organophosphorus flame retardants,OPFRs)阻燃剂因其具①有良好的阻燃特性,产量大,具有可塑性,易生产,而被广泛的ぷ使用,如电子、装饰,化工,纺织等行业,因其是直◣接混入材料中,有机磷酸酯极易释放到外界环境中,从大气,水体,土地,生物体内都监测到有机磷酸酯的存在,而相关研究表明,有机磷酸酯性质稳定,难以降解,具有环境持久性,毒理学研究表明OPFRs具有明显的致癌性,基因毒性和神经毒性,并能刺激人的皮肤[79-83]。Wang[84]等使用10, 50, 100, 300和600 μg/L TDCPP暴露斑马鱼胚胎,发现暴露引起了体重的减少,孵化率,存活率和心跳速率降低,增加了畸形率,进一步的分子实验表明TDCPP能显著性降低甲状腺激素水平,而增加整体甲腺原氨酸水平,引起了甲状腺内分泌干扰效应。Liu[85]等将斑马鱼暴露在TDCPP和TPP 21天后发现成鱼体中17β雌二醇,卵黄蛋白原水平显著上升,相关的CYP11A,CYP17,GnRH基因表达量都发生改变,得出TDCPP和TPP通过改变下丘脑-垂体-性腺轴调控机制而干扰性激素的平衡,最终达到干扰斑马鱼生殖行为。有机磷酸酯在结构上类似有神经毒性的有机磷◣农药[86],而在人居环境中大量存在有机磷酸酯,对人体健康有着潜◣在的危害。Dishaw[86]等通过在几种典型有机磷酸酯中暴露PC12细胞发现这些OPFRs比四溴联苯醚◆具有更强的神经毒性。Meeker[87]等初步研究表明有机磷酸酯能影响人激素水平并降低精子活性。 1.5.2 四种有机磷酸酯 磷酸三(2,3-二氯丙基)酯(tris(2,3-dichloropropyl) phosphate,TDCPP),使用量最广泛的有机磷酸酯阻燃剂,据报道在美国TDCPP从1998年的年产量4500吨快速增加到2006年的22700吨[88],环境中频繁的检测到了TDCPP的存在,如室内空气,灰尘,地表水,饮用水,河流,污水,沉积物和生物群体[88]。例如在地表水,报道TDCPP达到50 ng/L[89],而更高浓度的TDCPP在德国和挪威的污水处理厂出水中监测到,从20 ng/L到740 ng/L不等[88-90]。而在生物体中,发现TDCPP在鲈鱼体中达到36–140 g/kg脂肪重量[91]。在中国的松花江和太湖的沉积物中都检测到了TDCPP,浓度分分别是2.5-40 ng/L和0.62-5.54 g/kg[92, 93]。而目前ㄨ关于TDCPP的毒理学机≡制相关文献报道非常有限。急性毒性结果表明TDCPP毒害作用比其他OPFRs更强,虹鳟96小时半◤致死浓度是1.1 mg/L[94],而斑马鱼胚胎116小时半致死浓度是7.0 mg/L[81]。 磷酸三丁酯(Tributyl phosphate,TBP),广泛在核处理,化学工业,防火材料中使用的有机磷酸酯[95, 96],据报道引起了工人的恶心和头痛[97],环境中广泛↘存在,甚至在人血液和牛奶中也有检测到[98, 99]。而在海洋底部以从底泥和碎屑中觅食的底栖生物体内,发现肠道和肉中TBP最高含量分别为230 ng/g湿重和12 ng/g湿重[100]。但是目前人们对TBP的毒理认识还不足。 磷酸三(2-氯乙基)酯(Tris-(2-chloroethyl)-phosphate,TCEP)是一种典型的OPFRs,目前已经被列为痕量污染物名录[101],在世界范围内广泛的用于液体不饱和聚酯树脂的合成,纺织品背面涂层,PVC,纤维素酯化合物以及涂料[94]。TCEP曾经在1998年产量高达9000吨,但在1997年降至4000吨[101]。然而,TCEP作为一个典型的痕量污染物因为很低的去除率[102, 103],目前在地表水,污水处理厂出水,海洋和饮用水中浓度从ng/L到μg/L[89, 104]。对TCEP的毒理学研究已经在神经毒性,致畸性,致癌性上有所发现[105-108]。因此环境浓度的TCEP的潜在影响绝大多数还不清楚。 磷酸三(丁氧基乙基)酯(tris(2-butoxyethyl)phosphate, TBEP)也是一种广泛使用的OPFRs,Meyer[102]等通过检测德国某污水厂出水发现TBEP含量为 2400-6100ng/L,每年全世界的产量为5000到6000吨[94]。Sager[109]等发现TBEP可能结合β肾上腺素转运蛋白而影响β肾上腺素◣信号系统的生物学过程。目前对TBEP的毒理学研究非常少。 1.6河蚬的生物学背景及其在环境毒理学研究上的应用 1.6.1 河蚬的生物学背景 河蚬俗称黄蚬、沙喇、沙螺、蟟仔、蝲仔拉潜在获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列,清楚污染的和短序列后,我们获得了28,799,93新miRNAs预测二级结构 2.3.4 河蚬miRNAs的荧光定量 为了检测河蚬潜在miRNAs的组织分布,我们使用荧光定量PCR检测不同miRNAs在不同组织中的表达水平。特别地,4个新的(Novel-2, Novel-14, Novel-18 and Novel-31)和8个保守的(miR-10, miR-12, miR-67a, miR-184, miR-216a, miR-216b, miR-1985 and miR-1992)(图2-3)miRNAs被检测了表达水平。 结果显示9个miRNAs在腹足中表达量最高,然而miR-10和Novel-2在鳃和内脏团中表达量最高。此外,miR-1992在所有组织中表达相似。广泛的表达说明这个miRNAs肯与基础功能有关如代谢[154]。相比较而言,一些miRNAs高度显示了组织特异性。miR-67a和miR-1985在腹足中最高〗,接着是外套膜,鳃和内脏团。此外,我们发现miR-12主要在腹足中表达,然后依次是内脏团,鳃和外套膜。miR-216b主要在腹足和内脏团中表达而在鳃和外套膜中表达稀少。而且,miR-184和miR-10表达水平在鳃,腹足和外套膜中几乎一样,在内脏团中明显低。而在新miRNAs中,Novel-14和Novel-18在腹足和外套膜中表达丰富,在 鳃和内脏团表达量低。Novel-31在腹足中表达量最高,接着是外套膜和鳃,而在内脏团中非常低。Novel-2在鳃中很少表达,但在腹足外套膜和内脏团中表达高。 图2-3 8个保守和4个新miRNAs在河蚬4个组织中(鳃,腹足,内脏团,外套膜)的表达水平 2.3.5 河蚬miRNAs目的基因的预测 为了了解河蚬保守和新miRNAs的生物学功能,我们使用miRanda和RNAhybrid工具分析miRNAs和环境污染相关mRNA的关系。miRanda是一个基于核苷酸互补配对的miRNA目标基因预测软件,这款软件允许G=U假阳性,这在预测RNA:RNA复合体很关键[155]。可以用于人,老鼠,苍蝇和蠕虫的序列预测[156]。相比较而言,RNAhybrid是一款简单,快速并且灵活的任何物种miRNAs目的基因预测的软件[156]。这个工具能预测miRNA和mRNA的最佳结合位点,能计算杂交结构自由能。 结果显示所以的环境相关基因都有相应的miRNA作用(表2-3),metallothionein基因是miR-7的目标。miR-1992,miR-2b和Novel-40可能与调控 河蚬hsp70有关。我们的结果还显示miR-10和miR-1992可以作用于cyp4的3’非翻译区。然而我们没有发现两个软件对gst-pi基因预测的交集。图4-4显示了使用miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的交联关系。 图2-4 miRanda和RNAhybrid预测miRNAs和它们的目的基因潜在的关系 表2-3 miRanda和RNAhybrid预测的河蚬miRNAs与gst-pi, hsp70, cyp4和metallothionein的关系 Genes (gene ID) miRanda RNAhybrid Conserved Novel Conserved Novel gst-pi(AY885667.1) miR-315, miR-8a, miR-8b Novel-30, Novel-38 miR-277 Novel-1*, Novel-4 hsp70(KJ461738.1) miR-1992, miR-2a, miR-2b, miR-2c Novel-40 miR-1992, miR-2b, miR-34, Novel-29, Novel-40 cyp4(JQ678818.2) miR-10, miR-1992, miR-315 Novel-30, Novel-15, Novel-23, Novel-36 miR-10, miR-1992, miR-1994, miR-263, miR-285a, miR-285b, miR-34, miR-7 Novel-1*, Novel-14, Novel-17, Novel-29, Novel-3, Novel-4 metallothionein (EF185126.1) miR-1985, miR-315, miR-7, miR-7, miR-981 Novel-20, Novel-29, Novel-31, Novel-6a, Novel-6b, Novel-8 2.4 讨论 我们使用Solex测序技术获取了河蚬miRNAs数据,并进行了分析。发现保守的miRNAs表达比较高。之前的研究表明绝大多数确定的miRNAs的序列和功能在不同♀物种间是保守的[157]。miR-10在河蚬中是表达量最高达,文献报道它能抑制斑马鱼HoxB1a and HoxB3a基因[158],David Hassel等报道了它还可以通过促进血管内皮生长因子信号转导来调控斑马鱼和人血管内皮细胞的血管原行为[159]。而且在其他几个物种中发现miR-10能与一系列Hox 基因共表达,能调控Hox 转录本的翻译[160]。这些都将为以后研究河蚬miR-10的功能提供基础。Xu等[161]报道了牡蛎中miR-216b主要在消化腺中表达,接下来是鳃和外套膜。Wong等[162]研究发现miR-184的过量表达可能在细胞分化过程中引起舌鳞状细胞癌[162]。组织分布结果表明绝大多数河蚬miRNAs主要在2或3个组织中表达,仅有少数miRNAs在多组织中高度表达。 河蚬新miRNAs的表达量低, 在珍珠贝中53个新miRNAs中只有3个测序数大于100次[29],此外,25个花生新miRNAs中只有5个检测频率大于1000,绝大多数测序数小于100[163]。我们的结果与之前的研究是一致的[164, 165]。新miRNAs的低丰度表达表明了它们在某些组织中或特定发育阶段中发挥作用。 2.5 本章小结 在本研究ω 中,我们使用Solex深度测序总共从河蚬小RNA库获得28799934条高¤质量序列。鉴定了45条保守的和39条新的河蚬。使用荧光定量PCR验证了8个保守的和4个新的miRNAs,发现它们在4个组织中表达各有差异。此外我们还是用了2种软件预测了miRNAs和4个环境污染相关基因的关系。本研究的结果为深入了解河蚬和其他双壳贝类的miRNA提供了基础。 第三章 河蚬CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.1 引言 ? ?目前,人,老鼠等脊椎动物的神经肽研究的比较成熟,无脊椎动物神经肽研究主要集中在海蜗牛,牡蛎,章鱼等海洋软体动物,没有淡水双壳类动物的文献报道,神经肽的毒理学研究也很少,开发河蚬典型神经肽标志物,并应用于毒理学研究十分必要。本研究选取了CCK,Conopressin和FFamide神经肽作为研究基因。 本章以转录组测序获取的神经肽片段为参考,运用RACE技术,成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的全长,对全长序列进行了生物信息学分析,使用荧光定量PCR测量了↘神经肽在河蚬不同组织中的表达分布,并评估∮了有机磷酸酯对神经肽的影响,筛查了神经肽标志物。 3.2 材料与方法 3.2.1实验材料 3.2.1.1 试剂 TRIzol购自Invitrogen(USA)公司;荧光定量PCR试剂盒、琼脂糖、M-MLV试剂盒、Oligo-(dT) 18、DNase I和dNTP购自Promega(USA)公司;100 bp 和 2000 bp ladder购自天根生ぷ物(北京,中国)公司;SMART RACE cDNA amplification kit 购自Clontech(USA)公司;TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD20-T vector 和E.coli JM109 感受态细胞购自TaKaRa(Dalian, China)公司; 三氯甲烷,异丙醇和无水乙醇都是国产分析纯。 3.2.1.2实验仪器 Centrifuge 5804R离心机(eppendorf, USA) PowePac Basic电泳仪(BIO-RAD, USA) Gel Doc XR+凝胶成像仪(BIO-RAD, USA) 梯度热循环仪(Veriti thermal cycle system)(Life Technologies,USA) Multiskan GO ?酶标仪(Thermo Scientific,USA) 荧光定量 PCR 仪7500 Real-Time PCR system(Life Technologies,USA) 3.2.1.3统计分析与绘图软件 SPSS16.0 软件,Origin8.0软件 3.2.2河蚬的实验室养殖 河蚬购自洪泽湖,在盱眙县老子山镇洪泽湖码头采集,壳长在1-3cm 左右,年龄在1-2龄左右。带回实验室用恒温养殖系统进行驯养。采用流水养殖,建立一套恒温的流水系统进行养殖,选用水泥池流水循环系统养殖河蚬,以水泵提供流水动力,建有过滤池和养殖池,水经过水泵从过滤池传送到养殖池,再流回过滤池进行过滤。池底铺粒径为0.5 mm左右的细沙,所用水为500目纱绢过滤并充分曝气的自来水,室内温度使用空调控制,水温保持在20±1oC,水质硬度在250mg/L以下, 光照周期为12h:12h,饵料采用实验室纯培养的斜生栅藻和小球藻,或者以高级螺旋藻藻粉作为饵料。河蚬实验室养殖规范见█附录1。 3.2.3 RNA 提取和 cDNA 合成 3.2.3.1. RNA 提取操作步骤: 河蚬组织总RNA的提取采用Trizol试剂法,在无菌和无RNA酶的超净工作台进行,具体操作步骤如下: (1)取50-100mg河蚬组织迅速放入预冷的1.5 ml EP管,迅速加入200-300μL冰预冷的Trizol液,然后用电动棒碾磨均匀,接着加入冰预冷的800μL Trizol液,注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%,室温放置5min,使其充分裂解。 (2)以每1mlTrizol液加入0.2ml 的比例加入冰预冷的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15 秒,室温放置3 min,然后放入离心机,4℃,12000转,离心15min,吸取上层水相,尽量不要将沉淀吸入,移至另一1.5mLEP管中。 (3)每管加入500uL冰预冷的异丙醇混匀,室温放置10min。 (4)12000 g,4°C,离心10 min,弃上清,此时RNA沉于管底。 (5)用DEPC处理过的水和无水乙醇配制成75%乙醇,按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75% 冰预冷的乙醇,用手轻轻上下翻转约50次,用移液器反复吸吹悬浮的沉淀。 (6)8000 g,4°C下离心5min,尽量弃上清。 (7)室温瞭干,注意不要干燥过分,然后将RNA 溶于无核酸水中。利用DNA 的紫外分光光度计检测提取的RNA样品纯度和浓度。一般OD260/OD280>1.8时,样品纯度符合要求,其余的RNA于-80℃冻存,进行反转录合成。 3.2.3.2. 去除 RNA 中的 DNA (1)用 RNase-free DNase 去除样◤品中DNA污染。 DNaseⅠ消化处理反应体系(20μL) RNA 16μL DNaseⅠ 2 μL 10×DNaseⅠ Buffer 2μL Total volume 20 μL (2涡旋混匀后,37°C 水浴 30min。 (3)加入RQ1 DNase Stop Solution 1μL,混匀,瞬时离心,65°C 反应 10min。 (4)RNA浓度采用紫外分光光度计测定A260/A280 大于1.8,其余的RNA于-80℃冻存,进行反转录合成。 3.2.3.3. cDNA 第一链的合成 首先使用Multiskan GO酶标仪对提取并去除DNA污染的总RNA进行定量,使用Promega的M-MLV反转录系统。主要步骤如下: (1)在一支无核酸酶污染的小离心管中加入2μg总RNA,2μg随机引物和去离子水一共15μL,在金属浴中加热离心管到70℃,5min,这样可以打开模板的二级结构。然后立即在冰上冷却,以避免重新形成二级结构,短暂离心,使溶液归于管底; (2)按照下列表格的顺序和比例在上个步骤的离心管中加入反应体系的各个组分: M-MLV 5X Reaction Buffer 5μL dNTP混合液 1.25μL Rnasin核酸酶抑制剂25Units 0.75μL M-MLV Reverse Transcriptase 200U 1μL 无核酸水 2μL Total volume 25μL 轻弹或短暂离心混合溶液。37℃孵育60min进行反转录反应,然后在-20℃保存。 3.2.3.4. 3′和 5′RACE cDNA模板的合成 利用 SMART TM RACE Amplification Kit (Clontech)合成 RACE 模板。 (1)Buffer Mix 5×First-stand Buffer 4μL DTT(100mm) 0.5μL dNTP Mix(20mm) 1.0μL Total volume 5.5μL (2)5′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA 2μL 5′-CDS primer A 1μL Sterile H2O 8μL (3)3′RACE cDNA 去除 DNA 的 RNA 2μL 3′-CDS primer A 1μL Sterile H2O 9μL (4)(2)和(3)两离心管中的混合物分别混匀,短暂离心。 (5)72°C 下加热3min,然后42°C 下保温2min;在冰中冷却2min后 14000g离心10s。 (6)向5′RACE cDNA中加入1μL SMARTerⅡA oligonucleotide,轻微振荡后短暂离心。 (7)室温下混合以下试剂: Buffer Mix 5.5μL RNase inhibitor 0.5μL SMART Scribe Rererse Trancriptate(100U) 2μL Total volume 8μL (8)向上述混合液中分别加入(6)中的 5′RACE cDNA 和(3)中 3′RACE cDNA,终体积为 20μL。 (9)轻微振动离心管瞬时离心,42°C孵化90min,之后于 72°C下保温 10min。 (10)加入90μL Tricine-EDTA Buffer对RACE cDNA库进行稀释,cDNA库在-20°C可保存三个月,或在-80°C长期保存。 3.2.4河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆 3.2.4.1 3'RACE和5'RACE cDNA 扩增 根据本实验室转录组测序所得的CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因序列片段, 设计3'和5'RACE 特异性引物,引物设计采用 Primer Premier 5.0 软件进行, 所设计的引物由上海生工生物公司合成(表4-1)。 表3-1 基因克隆与荧光定量 PCR 所用引物序列 Primer name Primer sequence (5’→3’) Application CCK-F GAACAAGCAGAATGACGG qPCR CCK-R ACTCTTCGCCCTTTTACC Conopressin-F TCACTACATCGGTGACTATAA Conopressin-R ATGTTCAGAGTTCATATTGGG FFamide-F TACCGCTATCGCAATCTT FFamide-R GAAAAGGTTTAAGACATCA UPM CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCA ACGCAGAGT Universal primer CCK3F1 ATGCGTCCTCTTTTGTCAGC 3’RACE PCR CCK3F2 TCCTGGGATTATGATTACGG Conopressin3F1 GCTACCAACTGATTTCTCTATT Conopressin3F2 GGTCTAAATGGGCAGCCGTGTT FFamide3F1 CCTACGACGACGAAGAAAT FFamide3F2 AGAGCTATCTGGCGCTAGCAGA CCK5R1 AGGACGCATATTAACTTCTG 5’RACE PCR CCK5R2 AACTCGCGGTCATTTGCACT Conopressin5R1 TCCGGTCAGCAAAACAAAGT Conopressin5R2 GTCTTGGTATGCCTAGTATT FFamide5R1 TCACACATTTCTTCGTCGTC FFamide5R2 CTGTTCATGTTGGGGCTCAC CCK,Conopressin和FFamide神经肽基因的3'和5'引物(表 3-1)分别与通用引物UPM配对,利用SeqAmp? DNA Polymerase进行3'端和5'端扩增。反应体系为: 3'或5' RACE cDNA库 2.5μL 10×UPM 5μL 3'或5' GSP(10μM) 1μL PCR-Grade Water 15.5μL 2×SeqAmp? Buffer 25μL SeqAmp? DNA Polymerase 1μL Total volume 50μL 将上述体系轻微振动混匀,瞬时离心,放入 PCR 仪中进行以下反应: 反应程序: 95°C 预变性 3min 95°C 30s 72°C 3min 循环 5 94°C 变性 30s 68°C 退火 30s 72°C 延伸 3min 循环 25 72°C 延伸 10min 4°C 保存 For ever 取 2μL 反应产物,在 1.5% 的琼脂糖凝胶上进行检测,恒定电压为 120V, 电泳时长为 30min。 3.2.4.2 PCR 产物的分离与回收 根据电泳结果,使用Gel Doc XR+凝胶成像仪在紫外环境中给条带曝光,然后将含有目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶切下。胶回收纯化过程基本操作如下: (1)将切下的凝胶块放入 1.5mL 离心管中,每100mg凝胶加300-600μL Buffer B2。 (2)于50°C加热5-10min,其间晃动2~3min至离心管中凝胶全部溶解。 (3)将上述溶化的凝胶液全部移入吸附柱,8000g离心30s,将收集管中〒的液体倒掉,吸附柱重新放回收集管中。 (4)向吸附柱中加入300μL Buffer B2,9,000g 离心30s,倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。 (5)向吸附柱中加入 500μL Wash Solution,9000g离心 30s,倒掉收集 管中的废液,将吸附柱重新放入收集管中。 (6)重复步骤(5)一次。 (7)将空的吸附柱和收集管放入离心机中,9000g 离心 1min,室温下晾晒 5min。 (8)扔掉收集管,将吸附柱放到一个新的离心管中,向吸附膜中央加入 15μL Elution Buffer,室温放置 1~2min,9000g离心1min,收集 DNA 溶液, 该溶液可于-20°C 保存。 (9)将离心得到的DNA溶液重新加回吸附柱中,重复步骤(8),以提高DNA的回收量。 (10)琼脂糖凝胶电泳检测回收情况。 3.2.4.3 扩增片断连接并导入大肠杆菌细胞 使用pMD20-T Vector(TaKaRa)试剂盒将回收的DNA片断与T载体相连接, 连接反应体系如下: pMD20-T 1μL 纯化的DNA片断 1μL 无核酸水 3μL Solution Ⅰ 5μL Total volume 10μL 16°C 反应30min。 质粒转化 (1)取 100 μL 感受态细胞(JM109)在冰水中融化。 (2) 取10 μL 已转入目的片段的载体与感受态细胞溶液相混合,将混合物混匀,放置于冰上 30 min。 (3)在42°C水浴锅中热激45 s,立即放置于冰上冷却1min. (4)向离心管中加入890μL SOC无 AMP 液体培养基,吹打混匀,37°C下 于振荡培养箱中200 rpm培养60 min。 (5)室温下,4000rpm离心4min,将部分上清液吸出,剩下200μL 左右,吹打重新使细胞悬浮。 (6)将7 μL 20 mg/mL的IPTG和40 μL 20mg/mL 的X-Gal加∏入到含有AMP的平板培养基上,涂布均匀,然后加入100 μL的菌液,用涂布环(事先用酒精灯烧,放皿内侧冷却)涂平板。 (7)在37°C 恒温培养箱中正向培养1个小时,之后倒置培养过夜(12-14h)。 筛选阳性克隆 (1)按照1000:1的比例在 LB 液体培养基中加入AMP,混匀,向1.5 mL离心管中加入1 mL含有AMP的LB液体培养基,然后用无菌牙签从培养平板中挑取10个白色单菌往每个离心管中轻蘸几次,放入37°C振荡培养箱中200rpm培养6-8h。 (2)选择M13引物对阳性克隆进行PCR筛选,PCR 反应体系如下: GoTaq? Green Master Mix, 2X 12.5μL 菌液 2μL M13-F(10 μM) 1μL M13-R(10 μM) 1μL 无核酸水 8.5μL Total volume 25μL 用移液枪轻轻吹打,使 PCR 管中样品混匀,用小离心机进行瞬时离心,使样品聚于管底,之后进行 PCR 扩增,反应参数如下: 95°C预变性 5min 95°C变性 30s 58°C退火 30s 72°C延伸 1min 循环数 30 72°C延伸 10min 4°C保存 For ever (3)取5μL PCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,选择目的条带清晰的菌液进行测序。 3.2.5 序列分析 使用Bioedit软件对测序结果进行载体序列去除和序列拼接,使用Expasy (http://www.expasy.org/)预测开放阅读框(ORF)并翻译成氨基酸。使用DNAMAN7对CCK, Conopressin和FFamide基因的氨基酸序◎列进行同源性分析,运用PrediSi (http://www.predisi.de/)对信号肽进行了预测。 3.2.6 CCK, Conopressin and FFamide在不同组织中的相对定量分析 根据河蚬β-actin基因和克隆所得的CCK, Conopressin and FFamide基因序列, 设计了定量PCR引物 (附录5),进行相对基因表达量的检测。按照︽前述提取河蚬不同组织(包括内脏团、鳃、腹足和外套膜)的RNA并反转录合成cDNA。使用了Promega公司的Master Mix预混液,按照比例配置扩增体系。扩增体系总体积为20μL,其中PCR反应液包括10μL定量PCR Master Mix、0.4μL(200nM)正向引物、0.4μL(200nM)反向引物、2μL(100ng)cDNA模板,加无核酸水至20μL。PCR反应使用7500 Real-Time PCR system,程序为预变性95℃,5min;40个循环:95℃ 15s,55℃ 30s,72℃ 30s;最后一个循环做出熔解曲线:95℃ 30s,57℃ 30 s,72℃ 60s,为了确定产物的唯一性和实验的有效性。每个样品三次重复。内参基因为β-actin[41],目的基因的相对表达量根据2–ΔΔCt法计算[166]。实验的数据均通过SPSS 16.0进行数据分析。结果均表示为平均值±标准误差(means±SEM),实验组与对照组间差异分析用one-way ANOVA,差异显著性用Levene’s和LSDt-test检验,显著性←水平为p<0.05。柱状图使用作图软件Orign 8.0完成。 3.2.7 4种有机磷酸酯暴露下CCK, Conopressin and FFamide基因表达变化 河蚬的暴露采用半静水法,暴露容器为圆柱形玻璃缸,暴露液溶剂为5L,亚慢性暴露时间为30d,暴露期间保持环境条件稳定,并喂食人工培养的绿藻或纱绢过滤的螺旋藻粉,具体暴露条件和规范『见附录2。 毒性暴露时,选取体型大小相似、健康无伤的河蚬,平均体长15mm左右,随机放入各实验组,每个实验组30只。暴露组浓度设空白对照,20μg/L,200μg/L,2000μg/L的TDCPP,TBP,TBEP和TCEP,每组三个平行。对处理完毕的不同浓度暴露后内脏团组织样品进行总RNA提取,并反转为cDNA,以β-actin基因作为参照基因,反应体系和程序如 3.1.5,检测不同浓度TDCPP,TBP,TBEP和TCEP对河蚬内脏团CCK, Conopressin and FFamide基因表达量的影响,数据处理及分析同3.2.5。 3.3结果与分析 3.3.1 河蚬CCK, Conopressin and FFamide基因的cDNA克隆与序列分析 将测序获得的cDNA序列进行拼接分别得到河蚬CCK,Conopressin和FFamide基因全长(图3-1)。全长分别为1239 bp, 1352 bp和679 bp,其中5‘-UTR(非编码区)长分别为为413 bp,452 bp和85 bp,开放阅读框(ORF)长分别为522 bp,459 bp和273 bp,3’-UTR(非编码区)长分别为304 bp,441 bp和321 bp, 其中包括一个终止密码子,多聚腺苷酸加尾信号(Polyadenylation Signal Site)(AATAAA)和PolyA尾。 氨基酸序列分析表明,CCK神经肽由17个氨基酸组成,推导的分子量为19.18kDa。河蚬CCK神经肽与其他非脊椎动物多序列比较结果显示CCK氨基酸序列保守性低。例如与珍珠贝同源性为27.37%,与海蜗牛同源性为26.82%,与牡蛎同源性为22.35%。CCK的多重比对揭露了C末端的DYGLGGGRF在所选取的序列中完全保守(图3-2)。Blast和ClustalW分析显示Conopressin与大海鹿和海兔的同源性为42.20%,与牡蛎和珍珠贝的一致性分别为41.62%和38.15%。在这些物种中,N末端的CFIRNCP序列和C末端的GICCD序列】是完全保守的。推导的FFamide氨基酸序列通过BLAST and ClustalW分析得出与双壳贝类更加保守,例如珍珠贝(31.73%),牡蛎(29.81%),但在其他软体动物中保守性低一些,如耳鲍(27.88%),玄妙微鳍乌贼(24.04%)。在这五个物种中发现█NSLFF为高度保守序列。 图3-1 CCK, Conopressin and FFamide神经肽基因cDNA全长克隆序列和前体氨基酸序列 推导的氨基酸序列在核苷酸序列下方显示,推定的信号肽序列下面画黑色线,预测的神经肽成熟体标为红色并下划线,预测的运载蛋白标为紫色,基本剪切位点标为绿色,半胱氨酸残基蓝色,C末端酰胺化的甘氨酸标为橙色。 图3-2 河蚬CCK, Conopressin and FFamide神经肽基因前体氨基酸序列与其他物种的多重比对。在所有物种都保守的残基全标黑,只有一个不保守的全标灰色。使用的其他序列来源如下: CCK: 珍珠贝P .fucata (Pinctada fucata Genome Ver 1.00, scaffold3913.1|size60815pfu); 牡蛎C. gigas (EST CU986686, EST CU993470); 海蜗牛A.californica (XP_005096263.1). Conopressin: 珍珠贝P .fucata (Pinctada fucata Genome Ver 1.00, pfudmixc42469g19050 IsotigID scaffold414176.1:1..292); 牡蛎C. gigas (EST AM854257.1(A)/FQ666404(C)); 海蜗牛A.californica (ACN24615.1); 静水椎实螺L. stagnalis(AAB35220.1);大海鹿A. kurodai(BAB40371.1). FFamide: 珍珠贝P .fucata (Pinctada fucata Genome Ver 1.00, scaffold38094.1);牡蛎C. gigas (CU987867); 耳鲍H. asinina (EST GD272468.1); 玄妙微鳍乌贼I. paradoxus (EST DB917831.1). 3.3.2 CCK, Conopressin, and FFamide基因组织分布 利用荧光定量PCR分析了河蚬CCK, Conopressin, and FFamide基因在不同组织中的表达水平,结果表明(图3-3),CCK基因在内脏团中表达量最高,接着是外套膜,鳃和腹足。而对于Conopressin,除了在内脏团中表达量最高外,在鳃,腹足和外套膜中表达量都比较低。而FFamide在腹足和外套膜中极少表达除了内脏团和鳃。 图3-3 CCK, Conopressin和FFamide神经肽在河蚬内脏团、鳃、腹足和外套膜中表达量 3.3.3 4种有机磷酸酯暴露后CCK, Conopressin和FFamide基因表达量在内脏团中的变化 使用荧光PCR 检测了20, 200和2000 μg/L浓度的TDCPP,TBP,TBEP和TCEP 30天暴露后河蚬内脏团中CCK, Conopressin和FFamide基因相对表达量的变化(图3-4)。结果表明,200和2000μg/L的TDCPP暴露组使CCK基因表达量与对照组相比上调了2.12和2.09倍,显著性提≡高,而20μg/L暴露组对CCK表达没明显影响。TBP暴露组随着浓度升高,CCK表达量逐渐提高(200μg/L,2.43倍;2000μg/L,4.37倍),20μg/L处理中无明显变化。TBEP的所有浓度暴露组与对照组相比都显著上调CCK表达水平,分别升高了2.48倍,3.34倍,3.09倍。而TCEP暴露组对CCK表达水平没明显影响。4种有机磷酸酯只有TCEP暴露组显著上调了Conopressin基因相对表达量(20μg/L,2.77倍;200μg/L,2.68倍;和2000 μg/L,3.19倍)。FFamide表达水平都受到了4种有机磷酸酯的显著性诱导(p<0.05,图3-4),其中都是200μg/L处理组上调最高,呈现倒U型。 图3-4 四种有机磷酸酯对CCK神经肽mRNA相对表达量ξ 的影响 注:数据均使用 mean±SEM(n=3)表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验,显著性水平为 p < 0.05,* 表示具有显著性差异。 图3-5 四种有机磷酸酯对Conopressin神经肽mRNA相对表达量的影响 注:数据均使用 mean±SEM(n=3)表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验,显著性水平为 p < 0.05,* 表示具有显著性差异。 图3-6四种有机磷酸酯对FFamide神经肽mRNA相对表达量的影响 注:数据均使用 mean±SEM(n=3)表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验,显著性水平为 p < 0.05,* 表示具有显著性差异。 3.4结果讨论 3.4.1河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因cDNA全长克隆及序列分析 目前对神经肽基因的研究主要集中于脊椎动物和海洋软体动物,双壳贝类特别是我国淡水双壳贝类神经肽研究仍是一片空白,本研究首次克隆河蚬CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因 , 这3个基因全长分别为1239 bp, 1352 bp和679 bp,包括522 bp,459 bp和273 bp开放阅读框,分别编码173,152和90 个氨基酸,分析了这3个神经肽氨基酸序列的特征并用Blast和ClustalW与其他非脊椎软体动物进行了比对,发现CCK, Conopressin和FFamide神经肽的保守性在22.35%到42.20%之间,保守性较低,CCK具有DYGLGGGRF保守氨基酸,Conopressin神经肽N末端的CFIRNCP序列和C末端的GICCD序列是完全保守的,发现NSLFFN是FFamide神经肽的高度保守序列。在脊椎动物中CCK涉及到胰腺液的分泌[167],在非脊椎动物中CCK 在结构和功能上与胃泌激素有关,都是调控消化和进食[47],CCK的生物活性◇肽区域(QGSWDYDYGLGGGRF-NH2 and AKSYGDYSLGGGRF-NH2)与其他非脊椎动物◇非常保守. 第一个确定的Conopressin神经肽在结构上与vasopressin相关,在杀手芋№螺的毒液中发现[71]并且报道称在静水椎实螺中起到调控性行为的作用。在结构上,紧接着信号肽后面的是N末端Conopressin成熟体,序列是CFIRNCPPG-NH2,而毗邻C末端的神经垂体素包含14个半胱氨酸残基后面紧接着一个未剪切的和肽素同源区域。FFamide首先在静水椎实螺[168],帽贝[169]和比萨茶蜗牛[169]中发现,在结构上与节肢动物SIFamide神经肽类似[170]。突出了典型的软体动物FFamide神经肽前体的结构特征,即包含一个信号肽,通过在二碱基位点剪切出的2个FFamide成熟体序列。据报道,FFamide与果蝇输精管精子运输有关并且调控性行为[171]。在河蚬中,2个推定的FFamide生物活性区域是DEGYSRLVQQKPLLFamide和GVSPNMNSLFFamide。 3.4.2 CCK, Conopressin, and FFamide基因组织分布分析 河蚬CCK, Conopressin, and FFamide基因在各组织中都有所表达,在脊椎动物中,CCK在脑中的表达非常丰富[47, 78]。在比萨茶蜗牛中,Conopressin很清楚的在胰↓腺,腹足肌肉,阴茎,卵精巢和和射囊中鉴定出来[56]。尽管之前的研究发现软体动物神经肽主要在中枢神经系统[47]或神经器官[172]表达,但河蚬非常小很难将神经系统从其他组织分离出来,并且还没有河蚬神⌒经系统的报道。内脏团,鳃,腹足和外套膜经常被⌒用来分析河蚬基因的组织分布[173-175]。从组织表达的结果来看,3个神经肽都在内脏团中表达量最高。内脏团是一个包括许多器官的混合组织,河蚬神经系统可能包含于其中。而其他3个组织是单一并明确的,有限或没有神经系统在这些组织,因此CCK,Conopressin和FFamide神经肽的表达水平与在内脏团中相比很低或几乎没有。 3.4.3 4种有机磷酸酯暴露后CCK, Conopressin和FFamide基因表达变化分析 河蚬因其广泛的地理分布,与底泥直接接触而作为一个很合适的淡水环境检测物种[132, 176]。在目前研究中,我们使用河蚬内脏团中CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因表达的变化来评估TDCPP,TBP,TBEP和TCEP慢性暴露的影响。这四种典型的有机磷酸酯广泛的在阻燃剂和塑料工业中使用[88, 89, 177, 178]。目前还没有文献报道环境污染物暴露对脊椎和无脊椎动物CCK,Conopressin和FFamide表达的影响。文献报道了HgCl2比ZnCl2更能影响到gastrin/CCK8的行为和免疫反应[70]。 在我们的结果♀中200μg/L和2000μg/L TDCPP暴露下,CCK基因相※对表达量显著上调,并且上调倍数一直,说明CCK表达对这两个浓度的TDCPP暴露敏感,而20μg/L TDCPP暴露组对CCK表达无明显效应,说明CCK表达对该浓度TDCPP不敏感。TBP对CCK表达呈现∑ 出剂量-效应关系,浓度越高,诱导效应越强,CCK表达可以很好的反应不同浓度TBP暴露的影响,表明CCK是TBP潜在的生物标志物,TBP被认为具有神经毒性[179],而CCK是神经元细胞分泌的信号传递物质,可能TBP对河蚬神经系统有损伤并诱导了CCK的大量分泌。同样TBEP从低浓度到高浓度对CCK表达都有明显诱导效果,但文献关于TBEP的毒性报道十分有限,CCK对TBEP的敏感性比其他几个有机磷酸酯都要高,其具体影响机制还需要更深入的研究。不同浓度TCEP暴露对CCK表达水平没有明显影响,文献报道[108, 180]长时间的TCEP暴露后,大鼠大脑出现萎缩退化并有癌变效应,在这里CCK可能不是TCEP的作用靶点,CCK对TCEP也不敏感。 不同浓度的TDCPP,TBP和TBEP暴露对Conopressin表达没有明显效应,但TCEP的所有浓度都能引起Conopressin的显著性上调,结果表明Conopressin能很灵敏的指示TCEP的暴露影响,是TCEP的潜在生物标志物。 而FFamide神经肽◥基因相对表达量对不同浓度的4种OPFRs都呈现出倒U型,都是显著性上调,在20μg/L和200μg/L浓度下,随着浓度升高,FFamide相对于对照组表达量也越高,但在2000μg/L浓度下效应下∏降,可能是FFamide神经肽表达很容易受到有机磷酸酯的影响,在高浓度超过了分泌FFamide神经元细胞的能力,反而不如200μg/L处理组诱导效应高。之前有文献报道河蚬经常在3.13 mg/L 毒死蜱暴露下关闭双壳[9]. 河蚬闭壳的现象也曾在水中金属暴露下有过报道[181]。高浓度OPFRs暴露下河蚬可能通过闭壳来保护自身。四种OPFRs都对FFamide产生类似效应更加印证了,FFamide能很■好的标志OPFRs的影响。 3.5 本章小结 ? ? 本章通过RACE技术克隆了CCK, Conopressin和FFamide神经肽基因的全长序列,运用生物信息学软件分析了这些全长序列,使用荧光定量PCR测量了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布,并评估了有机磷酸酯对神经肽的影响,筛查了神经肽标志物。主要结论如下: 1、CCK, Conopressin和FFamide神经肽具有典型的软体动物神经肽特征,在不同组织的表达情况反映了神经细胞的分布。 2、TDCPP、TBP和TBEP对CCK神经肽基因都有不同程度上调影响,CCK基因可作为这3种有机磷酸酯的潜在标志物。仅有TCEP对Conopressin有显著诱导作用,而对CCK没有明显效应,可作为区别TCEP与其他污染物的标志物。4种OPFRs对FFamide都有显著效应,呈倒U型,表明FFamide能很灵敏的应答这4种标志物,高浓度的暴露效应下降,可能是降低了河蚬的健康水平,使其机能下降。 ? 第四章 有机磷酸酯TDCPP和TBP对河蚬毒性效应与作用机制研究 4.1 引言 ? ?目前,有机磷酸酯阻燃剂在生活生产中大量使用,而其对人和动物的毒理学效应还不是很清楚,本研究使用RNA-seq技术探究了TDCPP和TBP暴露后,河蚬转录组数据的变化,并对河蚬行为学指标,基因表达变化和酶活性进行了验证。 4.2 材料与方法 4.2.1 实验材料 磷酸三(1,3-二氯≡异丙基)酯(TDCPP,CAS:13674-87-8;纯度﹥98%); 中性红溶液(浓度为1 mg/L); 磷酸三丁酯(TBP,CAS:126-73-8;纯度﹥98%); 其中,由于有机磷酸酯不溶于水,将2种有机磷酸酯溶于丙酮并储存于棕色试剂瓶中,置于4℃冰箱中备用;中性红现配现用。 4.2.2 毒性暴露实验 暴露实验详见附录4。毒性暴露时,选取体型大小相近、健康无伤的河蚬,平均体长20.47±2.15mm左右,随机放入各实验组,每个实验组30只。暴露组浓度设空白对照,20μg/L,200μg/L,2000μg/L,每组三个平行。暴露阶段结束后采集河蚬的内脏团组织并提取蛋白和RNA于-80℃保存。 4.2.3 河蚬行为学指标测试 参照国内外文献中贝类行为学研究的方法,建立了能够应用到水生态毒理学中的河蚬行为学指标——虹吸作用的测试△方法。 方法如下:河蚬生活在水底,靠进水管和出水管过滤水中的食物为生,国外很早就有研究,利用河蚬的虹吸作用指标来监测水体中的环境污染物。本方法主要基于Cooper和 Bidwell(1996)的方法,在其方法的基础上进一步改进。暴露实验结束后,分别取空白组和暴露组各个组河蚬5只,立即放入盛有100mL中性红溶液(浓度为1mg/L)的烧杯中,使用分光光度计测定此时在530nm处的吸光值;2h以后再测定吸光值,根据以下公式计算河蚬的虹吸效率m(mL/animal/h)。 公式: ,(4-1) 注:M为测试溶液的体积,n是河蚬的数目,t为测试时间,c0 为开始测试时溶液的吸光值,ct为测试结束时溶液的吸光值。 4.2.4 河蚬生化指标测试 河蚬的生化测试指标包括河蚬内脏团组织中Caspase-3,Caspase-8和Caspase-9的酶活性。在测定之前,需要提取河蚬各个组织的蛋白,具体操作流程和步骤如下: 4.2.4.1蛋白提取 河蚬蛋白提取的方法,具体步骤如下: (1)取50-100mg内脏团组织于1.5mL EP管中,加入200μL裂解液I(30 mM Tris,2M硫脲,1% w/v DTT,7M尿素, 4% w/v CHAPS,蛋白酶抑制剂),置于冰上,用电动研磨器研磨充分。 (2)在研磨后的溶液中补充加入400μL裂解液I,混↙匀后置于冰上,间隔超声,功率80-100W,超声5s,冷却10s,共进行10个循环。 (3)4℃,12000×g离心10 min,取上清,避开上层油脂。 (4)每份样品取3μL用于蛋白定⊙量,定量步骤按2-D Quantity kit(GE Health)试剂盒说明进行。 (5)根据测得的蛋白浓度,将每份样品用裂解液稀释到3mg/mL。放于-80℃中备用。 4.2.4.2 Caspase-3,Caspase-8和Caspase-9酶活性测定 本实验测定了河蚬内脏团Caspase-3,Caspase-8和Caspase-9的酶活性,均采用购自碧云天生物技术研究所(中国江苏)的相应【试剂盒按照说明步骤进行测定,具体方法如下: Caspase 3酶活⌒ 性的检测: 1. 准备工作: a. 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。 b. 检¤测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。 2. 测定pNA标准曲线: a. 标准品稀释液的配制:按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。 b. 将试剂盒中的pNA (10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM,作为标准品。 c. 每个浓度取100μl用酶标仪进行检测,测定A405。 d. 用每一个标准品的A405减去空白〒对照的A405计算出@吸光度,并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线。 3. Caspase 3酶活性的检测: 将试剂盒中的Ac-DEVD-pNA (2mM),置于冰上融化。 如下设置反应体系: 空白对照 样品 检测缓冲液 40μL 40μL 待测样品 0μL 50μL 裂解液 50μL 0μL Ac-DEVD-pNA (2mM) 10μL 10μL 总体积 100μL 100μL c. 加¤完试剂后,将混合液在37oC保温60分钟。测定样品的A405。 d. 将样品的A405减去空白对照的A405,即为样品中Caspase 3催化产生的pNA产生的吸光度。通过标准曲线的计算就可以产生了多少量的pNA。 Caspase 8酶活性的检测: 试剂采用Caspase 8试剂盒,其他反应体系和步骤同Caspase 3 Caspase 9酶活性的检测: 试剂采用Caspase 9试剂盒,其他反应体系和步骤同Caspase 3 4.2.5 文库构建与测序 4.2.5.1 总RNA提取与质量鉴定 暴露实验结束后,分别提取空白对照组和2000μg/L TDCPP和2000μg/L TBP暴露组河蚬内脏团组织总RNA,为了获取尽可能多的转录本信息,我们采用混合样的方法,取样之前,停止喂食一个星期,取壳长20.47±2.36mm的成年河蚬5只,分别提取内脏团、鳃、腹足和外套膜等组织,进行总RNA提取,对总RNA纯化和鉴定后等比例混合。提取采用Trizol法。使用QUBIT2.0光度仪和安捷伦Agilent 2100 Bioanalyzer 进行RNA浓度和质量测定,将RIN≧8且260/280nm光度比值≧1.8的RNA进行下一步@ 建库和上机测序。 4.2.5.2 建库与测序 (1) mRNA纯化与片段化。取4μg总RNA建库,用带有 Oligod(T)的 Beads 对 Total RNA 中 mRNA 进行纯化,然后选择合适程序对mRNA进行片段化; (2) cDNA合成与末端修复。使用Second Strand Synthesis Enzyme Mix和合适程序进行cDNA合成,并在3’端加A; (3) PCR扩增与产物富☆集。使用合适程序进行PCR使文库产物富集,将产物电泳后切胶纯化。 (4) 文库质控。使用 2100 Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip 判断 PCR切胶产物片段大小是否符合后续测序的要求; (5) 混合文库。根据文库的定量及定性结果将每个 library 的摩尔浓度统一调整到 2nM,然后根据实验设计选择性的将需要混合的 library 进行等量等浓度混合,保证混合后的 library 的终浓度也是 2nM,体积大于等于 10 μL ,然后将文库进行-80℃保存。 (6) 上机测序。使用Illumina平台进行双向测序,得到测序数据。 4.2.6 转录本生物信息学分析 对测序得到的原始 reads(双端序列)进行过滤后,将高质量的 reads进行转录本的组装,对转录本进行结构注释和功能注释。把 clean reads 回帖到参考序列上,再基于回帖结果进行表达量分析、差异表达基因功能注释等高级分析。 4.2.6.1测序数据过滤及统计 对原始数ω据进行过滤,使用 ngsQCToolkit-2.3.3 2 软件过滤掉低质量 reads 和有引物污染的 reads。 4.2.6.2 转录本组装 使用 Trinity 3 对 clean reads 进行组装,Trinity 利用 de Bruijn graph path 算法对 reads进行 denovo 拼接。得到组装后的 Unigene Library(Trinity.fasta),过滤掉外∩显子总长低于 200bp 的转录本后,得到一个最终的转录本序列文件。 4.2.6.3功能注释 使用 blast 软件将转录本序列与各主流数据库(Nt,Nr,GO,KEGG,Swiss-Port)进行比对;利用 HMMER 7 进行蛋白质结构域预测】;signalP 8 进行信号蛋白预测;tmHMM 进行跨膜区域预测,最后利用Trinotate 整合注释结果。 ? 4.2.6.4表达量分析 在 RNA-seq 分析中,我们可以通过定位到基因组区域或基因外显子区的测序片段(Fragment,一条 fragment 指一对 reads 所在的序列片段)计数来估计基因的表达水平。Fragment 计数除了与基因的真实表达水平成正比外,还与基因的长度、测序深度成正相关。为了使不同基因、不同实验间估计的基因表达水平具有可比性,引入 FPKM 9 的概念,FPKM (Fragments Per Kilo bases per Million fragmentss)是每百万测序片段中来自某一基因每千碱基长度的片段数目。FPKM 同时考虑了测序深度和基因长度对 reads 计数的影响,是目前最为常用的基因表达水平估算方法。 = (Total exon fragments)/(mapped reads(Millions)×exonlength(KB) )(公式4-2) 我们使用 RSEM 软件进行表达量分析。 4.2.6.5 差异表达基因分析 使用 edgeR 10 找出不同样本间存在差异表达的转录本。挑选|log 2 FC|>=1 并且p value<=0.001 2="" log="" fc="">=1 即为TDCPP和TBP暴露组上调基因,log 2 FC<=-1 为TDCPP和TBP暴露组下调基因。 4.2.6.6差异表达基因GO注释和KEGG富集 ? ?根据实验目的ω 筛选差异基因后,我们对差异转录本进行了GO 注释和KEGG富集分析,研究差异转录本形成的KEGG信号通路 4.2.7 基因定量验证 使用河蚬β-actin基因作为内参基因,本实验首先对河蚬凋亡系统相关基因进行了基因定量验证,定量PCR引物见附录5。 4.2.8数据处理与分析 结果均表示为平均值±标准误差(means±SEM),实验组与对照组间差异分析用one-way ANOVA,差异显著性用Levene’s和LSDt-test检验,显著性水平为p<0.05。柱状图使用作图软件Orign 8.0完成。 4.3结果与分析 4.3.1 虹吸行为指标测试 30d的暴露实验〇期间,河蚬死亡率小于3%,且各实验组间死亡率没显著差异。对河蚬的虹吸行为测试结果表明(图4-3,4-4):随着TDCPP和TBP暴露浓度的升高,河蚬虹吸速率逐渐下降。 ? 图4-3 TDCPP对河蚬虹吸效率的影响 注:河蚬虹吸效率(Filtration rate)的单位为mL/animal/h,即每只河蚬每小时的过滤水的体积。数据均使用 mean±SEM(n=5)表示。 图4-4 TBP对河蚬虹吸效率的影响 注:河蚬虹吸效率(Filtration rate)的单位为mL/animal/h,即每只河蚬每小时的过滤水的体积。数据均使用 mean±SEM(n=5)表示。 4.3.2 凋亡相关酶活力测试 根据转录组测序结果,为了进一步探究TDCPP和TBP对河蚬主要毒理机制,暴露实验结束后,提取了河蚬内脏团蛋白样进行Caspase 3,Caspase 8和Caspase 9的酶活性测试。结果见图4-5。其中TDCPP对Caspase 3和Caspase 8活性都有显著性诱导,而只有200μg/L和2000μg/L TBP对Caspase 3和Caspase 8活性有显著诱导。另外TDCPP和TBP对Caspase 9的有上调趋势,但不明显。 图4-5 TDCPP和TBP对Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9活性的影响 注:数据均使用 mean±SEM(n=3)表示。使用单因素方差分析进行显著性水平检验,显著性水平为 p < 0.05,* 表示具有显著性差异。 4.3.3 转录组差异表达分析 4.3.3.1 Illumina测序与序列组装 提取空白组↑,TDCPP和TBP暴露组河蚬内脏团组织进行建库、测序,去除低质量的reads,所有样品过滤前后数据量及质量值统计情况如下表4-2所示: 表4-2 样品过滤前后数据量及质量值统计 Sample Raw Reads Number Raw Bases Clean Reads Number Clean Bases Clean Rate(%) Q20(%) Q30(%) CK 61193398 7710368148 58779228 7406182728 96.06 97.38 94.46 TDCPP 49179514 6196618764 47531434 5988960684 96.65 97.97 95.58 TBP 48210200 6074485200 46529664 5862737664 96.52 97.81 95.27 使用 Trinity 3 对 clean reads 进行De novo组装,对 Trinity.fasta 进行统计分析得到如下内容: 图4-6 河蚬转录本序列长度分布与所占百分比 4.3.3.2 转录本的比对与注释 本实验使用 blast 软件将转录本序列与各主流数据库(Nt,Nr,GO,KEGG,Swiss-Port)进行比对,利用 HMMER 7 进行蛋白质结构域预测;signalP 8 进行信号蛋白预测;tmHMM 进行跨膜区域预测,最后利用Trinotate 整合注释结果。具体结果见图4-3。 表4-3 注释整合结♀果 数据库 转录本数 注释率% 总转录本 160698 100 Nt 18271 11.4% Nr 17476 10.9% KEGG 8942 5.6% Swiss-Port 23940 14.9% GO 3722 2.3% Pfam ? 9999 6.2% signalP 9999 6.2% TMhmm 6802 4.2% 4.3.3.3 转录本的鉴定与富集分析 首先使用FRKM方法对转录组的表达水平进行标准化,然后对TDCPP,TBP暴露组与空白对照组鉴定出差异转录本(Differentially expressed transcripts,DETs)。结果显示TDCPP暴露后表达水平有差异的转录本DETs合计8160个(p<0.001,图),其中4037个DETs显著性上调(与对照组相比,表达水▲平倍数大于等于2),4123个DETs显著性下调(与对照组相比,表达水平倍数大于等于2),而TBP暴露后表达水平有差异的转录本合计8207个(p<0.001,图),其中4162个DETS显著上调与对照组相比,表达水平倍数大于等于2),4045个DETs显著下调与对照组相比,表达水平倍数大于等于2),根据KEGG数据库注释结果,富集出了TDCPP和TBP分别对河蚬的主要作用通路,这里选取前十名的」通路列表。 347个DETs注释到了KEGG信号通路,其中TDCPP对河蚬的主要作用通路包括凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相关通路。而共有369个DETs注释到了KEGG信号通路,其中TBP对河蚬的主要作用通路包括凋亡通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路等相关通路。 表4-4 TDCPP暴露后DETs的KEGG富集 通路编号 通路名称 DETs ko04210 Apoptosis 49 ko04510 Focal adhesion 56 ko05222 Small cell lung cancer 40 ko05145 Toxoplasmosis 45 ko04514 Cell adhesion molecules (CAMs) 24 ko04064 NF-kappa B signaling pathway 33 ko04640 Hematopoietic cell lineage 15 ko05164 Influenza A 33 ko05134 Legionellosis 24 ko04668 TNF signaling pathway 28 表4-5 TBP暴露后DETs的KEGG富集 通路编号 通路名称 DETs ko04210 Apoptosis 58 ko04970 Salivary secretion 46 ko04514 Cell adhesion molecules (CAMs) 32 ko05145 Toxoplasmosis 53 ko04640 Hematopoietic cell lineage 21 ko04064 NF-kappa B signaling pathway 40 ko05222 Small cell lung cancer 44 ko04662 B cell receptor signaling pathway 21 ko04911 Insulin secretion 20 ko05164 Influenza A 34 4.3.3.4 TDCPP和TBP暴露对河蚬凋亡通路作用机制分析 结合KEGG通路情况,分析了TDCPP和TBP暴露对河蚬凋亡通路的影响。TDCPP和TBP都对河蚬凋亡通路产生了影响。TDCPP和TBP作为凋亡刺激源,激活河蚬凋亡通路,分为两种途径(图4-7),1)线粒体途径,诱导线粒体中细胞色素C上调释放,自由的细胞色素C使Apaf-1与Caspase 9结合体瓦解,Caspase 9自由体将ProCaspase 3转换成Caspase 3成熟体,导致了细胞的凋亡;2)TDCPP和TBP结合到细胞膜的死亡配体结合位点,进而使Caspase 8从结合体上释放,将ProCaspase 3转换成Caspase 3成熟体,导致了细胞的凋亡。 图4-7 凋亡通路示意图 4.3.4 凋亡相关基因的验证 暴露实验结束后,使用荧光定量PCR检测了河蚬内脏团中凋亡相关基因(Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9以及Cytochrome C)的表达变化,结果表明(图4-8,4-9),随着你的的升高,TDCPP对Caspase 3,Caspase 8,Caspase 9以及Cytochrome C基因都有上调趋势,其中200μg/L和2000结果验证了RNA-Seq差异转录本分析出的凋亡通路结果。 4.5 本章小结 ? ?本章通过对TDCPP过Selox测序获取并鉴定了河█蚬保守和新miRNAs,预测了miRNA与4个环境相关基因的关系,为研究miRNA在环境毒理学上的应用█提供了基础。填补了河蚬miRNA生物信息的不足。运用RNA-Seq表达谱技术分析了TDCPP和TBP暴露后河【蚬的差异转录本,重点分析凋亡通路,并验证了生化和基因指标,与RNA-Seq结论一致,并且主要是通过外源凋亡途径,还分析得出TDCPP比TBP对河蚬的凋亡效应强。成功克隆了CCK,Conopressin和FFamide神经肽cDNA全长基因,并对它们的氨基酸序列进行了同源性比对和分析,开发并初步应用了河蚬神经肽标志物,评估了四种有机磷酸酯的毒性效应,对应用这些标志物完成了实验论证。 目前,我国水体污染的生态毒理学研究还处在发展阶段,大量的化学品与相关标志物的筛查还需要进一步研究,以河蚬为受试生物并结合RNA-Seq开发生物标志物的方法能很好的评估化学品的毒性效应与机制,但是还需要完善几个方面: 1、河蚬生物信息学比较缺乏,亟待开发出完整的生物信息学背景; 2、神经肽标志物的开发还处于起步阶段,完善的标志物评估体系需要进一步建立起来; 3、目前的研¤究仅以成年河蚬为受试对象,以后需要建立针对河蚬受精卵、幼蚬的毒性测试方法。

                学生躲避全副武装的枪手,

                表示超级害怕



                ????学校立刻拉响警报,紧急疏散学生,并封锁学校。


                学生纷纷涌出教室



                ????当地警方出动了多辆警车,其中包括一辆坦克和特警部队。



                枪手在射击多发子弹后逃跑,不过随后被警方逮捕。


                据《Daily Mail》报道,枪手是学校以前的学生Nicolas de Jesus Cruz,也曾是美国陆军少年后备军官训练团前任成员



                作案当时他身穿褐红色上衣,下身穿一条黑色裤子,手持一把长枪,头带防毒面①具。警察表示他就是全!副!武!装!


                在案发之前,枪手就被学校禁止背包进去校园



                有多名学生表示:


                连续听到6声枪响!


                大家都在疯狂的向外跑,所有人都在喊叫!


                我还在逃跑的时候弄伤了脚!


                有的人最后一刻才知道发生了枪击案,都以为是日常火警演习!


                我们和朋友跑进一个壁橱里。



                也有人表示:


                一说枪击案我们就知道凶手一定是他!因为凶手的社交网站上分享的都是枪支弹药!



                家长们纷纷赶到现场,不能进入学校,都心急如焚■...



                特朗普在社交网站上表示:


                我为在佛罗里达州的受害者和家人们祈祷,并表示哀悼!在美国校园里,不应该有任何孩子、老师感到不安。



                5分钟后,他再发一条表示:


                我已经和州长Rick Scoot通过电话,会与执法部门合作调查枪击事件始末。


                就在半年前,美国拉斯维加斯发生了另一起惨烈的屠杀事件,枪手扫射演唱会现场造成了59死,527伤的恐怖事件,时隔不久,悲剧再次上演,它们彻底暴露出了美国政府在枪支管制方面的无◣能,以及管理体系的孱弱


                以下是其他几个案◣例


                2016年6月12日,声称效忠极端组织“伊斯兰国”的奥马尔·马丁在佛罗里达州奥兰多市“脉动”夜总会开枪扫射并挟持人质与警方对峙,致死49人、致伤53人,当时成为美国死亡人数最多的枪击案,也是“9·11”事件后美国最严重的恐怖袭击事件。


                2007年4月,弗吉尼亚理工大学发生枪击案,32人死亡,15人受伤。2012年12月,康涅狄格州桑迪胡克小学枪击案,20名儿童和6名成年人遇难。



                1995年4月19日,海湾战争老兵蒂莫西·麦克维制造俄克拉荷马城联邦大楼爆炸案,造成168人死亡,500多人受伤。


                美国是世界上私人枪支持有量最多的国家,曾任美国联邦调查局助理局长的罗恩·郝思科透露,全国大概有3亿支枪。联合国的数据显示,美国枪击凶杀率在发达国家中高居首位,约为加拿大的6倍、德国的16倍。


                根据纽约时报的一项统计,在美国,被枪支打死的概率就像被汽车撞死一样高!与之相比,在澳大利亚,这个概率大概相当于自己不小心从建筑上掉下来摔死……在中国,这个概率相当∴于坠机而死……



                与美国相比,另一个主要西方移民国家加拿大也没好到哪里去,就在上周,加拿大的埃德蒙顿刚刚发生恐怖袭击!


                当地时间①上周六晚,加拿大艾伯特省首府埃德蒙顿市的繁华地区发生了一起袭击事件。袭击者在持刀刺伤了一名执勤的警察后,并驾车撞击路人另造成4名行人受¤伤。


                警方随后逮捕了╳该名男子,并从他租来的犯罪车辆中,发现了恐怖组织“伊斯兰国”的旗帜。加拿大政府宣称这是一起恐怖袭击事件。



                据悉,袭击事件发生在埃德蒙顿市西部的英联邦体育场外。根据现场目击者提供的消息显示,参与此案的袭击者是一名大约30岁左右的当地居民。他在持刀刺伤了一名警察后,便驾驶着从U-Haul搬家公司租来的小货车,开车冲撞附近的警察巡逻车,并与随后前来支援的警方开展了公路追逐战。


                在历经了几个小时的追捕后,该男子驾驶的货车翻车,其本人随后遭到了警察的包围并被逮捕。但有4名行人在这一追逐过程中,被他驾驶的车辆撞伤。


                同样是移民目的地的英国,近年来同样连续爆发恐怖袭击事件


                今年9月,伦敦一辆地铁列车突然发生爆炸,事件造成23人受伤;今年3月,在议会大厦附近发生一起撞车和持刀攻击;今年5月,在曼彻斯特演唱会发生一起自杀式爆炸;今年6月在伦敦桥附近发√生一起货车和持刀袭击。在今年发生四起恐怖袭击之后,英国处于高度戒备状况,并挫ζ败多起恐袭阴谋。


                无论你◆在世界的哪个地方,

                都能平平安安!

                我希望,世界和平!

                朋友 图片 表情 草稿箱
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