一， 水产病原菌的分离

分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病水产动物，病原⊙菌的分离方法如下：

1、接种分离

? ? ?体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，直接在普通琼脂平板上划＠线分离。

? ? 内部组织器︽官：用 70%酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料， 先将拟分离病原的部位表面用 70%酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧后的解剖刀烫烧，以杀死表面的杂菌，随即在烧灼部位刺ξ　一小孔，用灭菌的接种环（待冷 2 ～ 5 秒）伸向烧灼部小洞中，用手指将接种环轻轻旋转两次，借以达到取足材料的目的。

? ? 鳃部：用无菌接种环刮取鳃上的分泌物划平板。

? ? 血液♀及体液：用无菌注射器吸取病鱼血液和体液，滴于平板涂布；或用灭菌后的接种环挑取血液和体液后于平板上划线，分离细菌。

划线分离的方法：左手持握普通琼脂平板，并靠近火焰↑，右手持取〖材后的接种环在琼脂平板上分区划线接种。划线时接种︼环面与平板表面成 30 ～ 40 度的角轻轻接触，在平板表面轻快地移动，接种环不应嵌入培养基内，且不要重复，否则形成菌苔。划线完毕，盖上皿盖，接种环灭菌后放下〇，并在平皿底部≡用记号笔注明接种材料、日期及操作者代号。

? ? 也可对实质性脏器用无菌剪刀下一小块，用镊子夹住病料使其剖面接触洁净的玻片，作多个触片，革兰氏染色后在显微镜下直接镜检，对于特征明显的细菌能快速获得大致结果。

2、培养和观察

? ? 接种后的平板经 30 ℃ 左右培养 24 ～ 72h 后，检查菌落生长▃情况，对菌落检查的主要内容包括：

（ 1 ）大小：其大小以 mm 表示，微小菌落：针尖大，直径小于 0 . 5mm ，如支原体菌落、猪丹毒杆菌菌落；小菌落：直径在 0 . 5 ～ 1 mm 之间，如嗜血杆菌、布氏杆菌菌落；中等大小的╱菌落：直径在 1 ～ 3 mm 之间，如巴↙氏杆菌、沙门氏杆菌菌落；大的菌落：直径大于 3mm ，如炭疽芽孢杆菌菌落等。

（ 2 ）形态：圆形，不规则形（根状、树叶状）。

（ 3 ）边缘：整齐，不整齐（锯齿状、虫蚀状、卷发状）。

（ 4 ）表面：光滑、粘液状、粗糙、荷包蛋状、漩涡状、颗粒状。

（ 5 ）隆起度：隆起，轻度隆起，，平升状、扁平状，脐状（凹陷状）。

（ 6 ）颜色：无色、灰白色、白色、金黄色、红色、粉红色。

（ 7 ）透明度：透明、半透明、不透明。

（ 8 ）溶血性： β －溶血（完全溶血）， α －溶血（不完全溶血），不溶血。

根据菌落数量和特征，挑选可能的病原菌菌落（一般是』占优势的菌）进一步划线纯化 1 ～ 2 次后，将经纯化的可能病原菌用于感染试验。

3、病原」菌的确定

? ? ?将从患病材料中分离的所有可能病原菌经纯化和扩大培养后分别进行人工感染实验。目前最常用的人工感染接种方法有浸泡、口服和注射法等，究竟选『用哪一种方法最合适，需要根据不同的疾病类型和可能㊣　的侵入途径而定。如体表的病，可采用浸泡法（包括创伤浸泡）；体内的疾病，可采用口〓服、注射法。由于绝大部分病原菌都是条件致病菌，因此在人工感染实验时还要注意感染菌的用量△︽，接种量过大，即使该菌并不是引起实验材料致病的病原菌，也可能会因大量菌体裂解释放的大量内毒素而使感染生物死∮亡，为了量化感染菌的危害程度，可以测定感染细菌对〓接种动物的半数致死量（ LD 50 ），根据 LD 50 的大小来判断其①致病力的强弱。只有 LD 50 相对较低、感染引起的死亡与实验材料有相同症状、并且经回接实验还能分离到相同的细菌时，才能确定所分离的细菌为引起实验材料致病的病原。

? ?在感染实验时，感染对象要求是▲没有患病史的同种生物，在感染前要经∮过 1 ～ 2 周的暂养，感染数量要 30 尾以上（至少要 10 尾以上）。必要时，还要将温度控制在◣适合疾病爆发的水平。感染过程中要 定时投饵和换水，同时安排合适的对照组。

4、病原菌的鉴定

? ? 分别观察病原菌的形态以及检测其各种↑生理生化指标，通过查∴阅伯杰氏手册确定病原菌的种类；也可直接用细菌鉴定仪测定病◢原菌的种类。

5、结果与报告

? ? ? ? 报告所分离的水产动物病原菌的各种鉴定特征，并查阅相关的细菌鉴定手册初步判断病原菌的种〒类。

二， 药敏试验。

? ? 药敏试验的意义在于预测使用的抗菌药物临床治疗效果，如果选→择的抗菌药物对致病菌的药敏试验结果为“敏感”时，使用该抗生素治疗可能有效，试验结果为“耐药”时，治疗肯定无效，可以为水生动物细菌性疾病的治疗过程中，提供抗生素选择的卐依据。

? ? ?临床微生物实验室进行药敏∑　试验的方法主要有纸片扩散法，稀释法（包括琼脂和肉汤稀释法），抗生素浓度梯度法（E-test法），和自动化仪器等。水产微生物最常用到的是纸片扩散法和稀◆释法。

? ? ?（一）纸片扩散法：该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼↙脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。

? ? ? 同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外⌒的菌株则可以生长，从而在〖纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC（最Ψ 小抑制浓度）呈负相关。抑菌圈越大，MIC越小。

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1、实验材料

（1）、培养基：

目前水产常用的有以下几种

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（2）、药敏试纸：购买或㊣　自制（详见实验准备）

（3）、细菌：待做药敏试验的细菌（包括水产动物病变组织、体液或已分离培养的菌种等）

（4）、仪器：解剖剪、镊子、接种环、酒精灯、移液器、滴头。

2、实验准备

（1）、药液▲的制备：按↓商品药的使用治疗量的比例配制药液，如取10%的氟苯尼○考80～100微克加入1ml的水中◣混匀，可按这个比例配制药液。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。

（2）、药敏片的准备

（3）取医疗器械公司购买定性滤纸，用打孔机∞打成6毫↓米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的空瓶中，瓶口以单层牛皮纸①包扎。经15磅15～20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。

（4）在上述含有50片纸片的瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸☉片，使各纸片◤充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗Ψ干燥处存放，有效期3～6个月。

3、操作方法

1、细菌涂布

? ? 1）取病变组织或☉体液（肝、脾、肾，肠脓液等），轻轻在平板上均匀涂一层。具体方式：用灭菌解∴剖剪和镊子，剪取动物病变组织；或用灭菌棉拭子蘸取病变部位体液，在平板上轻轻涂布均匀。此方法适合临床快速确定选择用药。

? ?2）若已做细菌分离培养，在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌〖的接种环挑取细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培ㄨ养基上。具体方式：用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐∩水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面∑　。要求涂布均匀致密，直接悬液法要把菌液浓度用生理盐水或PBS调到0.5个麦氏标准再涂布均匀。）

麦氏标准管配制?

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? ? ?麦氏浊度法是一种比较粗略的方∩法，常用于目测比较☆菌液浓度。例如，药敏实验中常用一个标准的0.5麦氏浊度管（有市售，如杭州天和微生物试剂公司有售，也可自己用BaSO4配制）和培养的菌液在单纯背景光下比较，大致估计培养菌液的浓度。?

? ? ?一般实验室有分光ζ光度计即可以测细菌浊度了★，根据美国CLSI(以前称NCCLS)推荐的方法，将菌液调〖整至OD625值在0.08-0.13之间就相当于0.5麦氏浊度了?

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? ? ?a, 从孵育了16-24小时的琼脂平板上（血平板）已经分离纯化的菌落，挑出单个菌落4-5个，接种到3-5毫升MH肉汤中，在35℃条件ω　下培养4-6小时，再用肉♀汤调整菌液至0.5麦氏单位。?

? ? ?b, 在15分钟内，用无菌棉拭子蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的菌液。?

? ? ?c, 用棉拭子在无菌的M-H培养基表面化线接种，棉签※与平板呈30度角左右的倾角密集来回涂布，完成一遍后，将平ぷ板转动120度，再次涂抹。每次接种都应保证接种物均匀分布，最后用棉拭子涂抹平板的边缘。

平板在室温下干燥3-5分钟，用无菌化的镊子和商品化的纸片分配器将Ψ含药纸片紧贴于琼脂表面， ??

? ? ?2、贴药敏片将镊子于酒精灯火焰【灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基∮表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；，外周可等距离贴若干片（外周一般」可贴七片），每种药【敏片的名称要在培养皿上标注。各纸片之间的距离不小于25mm，各纸片离平板內缘◤大于15毫米。

3、培养

将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

4、结果观察

? 在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度「递减，因此在纸片周围▆一定距离内的细菌生长№受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直ω径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直▆接关系。

5、判定标准

药敏实验的结果，应按抑菌圈直径ㄨ大小作为判定敏感度高低的标准。

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? 具体对于不同的菌株，及不同的抗生素纸片需参照NCCLs的标准或〗者CLSI标准。

6.药敏试验ω结果影响因素。

（1）.培养基：

? ? 应根□　据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板』时，厚度合适（4mm左右），不可太薄或者太厚，一般90mm直径的培养皿，培养基的pH在7.2-7.4，否则影响药物的敏感性。

? ? 培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨◆苯甲酸（PABA）能拮ω　抗磺胺药和TMP的活性。?

（2）.细菌接种量：

　　细菌接种量应◎恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。?

（3）.药物浓度：

　　药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精◣确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。?

（4）.培养时间：

　　一般培养温度和时间为37℃8-18小时，有些抗菌药扩散慢如¤多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌※的生长，而得到较大的抑菌圈。?

7、应用

药物敏卐感实验后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助使用，以减少々耐药菌株。在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，因为我们药敏实验是药液直接和细菌接触，而在给水产动物用药的时候，必须通过机体的吸收才能使药物〇达到一定的」效果，所以在治疗水产动物疾病时，高敏药物一█定要配合适宜的给药方法，这样才会达到好。

（二）稀释法。

? ? ? ?稀释法药敏试验是定量试验，可确定被检菌对某抗菌药物的MIC和杀∑　菌浓度(MBC)。稀释法可作为评价标准，特别是琼脂稀释法←被誉为金标准。其他方法必须与稀释法比较才能确定其可靠性。肉≡汤稀释法被检菌必须分别接种一种含不同浓度抗菌药物系列管，工作量大，只适用于小量标本。琼脂稀释法则几十个被检菌可同时接种在含定量浓度抗菌药物的平板上，适用大量标本或研究工作△。稀释法允许误差是被检菌接种含倍比系列稀释抗菌药的←培养基内(至少5个倍比稀释)，测出值不超过3个连续倍比稀释值(靶值±1个倍比稀释浓〖度)。

主要测定细菌对某药的最低抑菌浓度，包括肉汤稀释法和】琼脂稀释法。

? ? ? 琼脂稀释法：原理：将不同剂量的抗菌药物加入融化并冷至50℃左右的№定量MH琼脂中，制成含有不同递减浓度药物的平板。接种待没测菌（可在一个平板上做多株测定），35℃孵育16－24h，无细菌生长的最低药物浓度为测♀试菌的MIC。

? ? ?本试验特点是可同时【做多株菌株的MIC测定，结果的重复性优于肉汤稀释法，且易于发↓现污染或耐药突变菌，是新药证时常用的外药敏试验经典参照标准。

（一）肉汤稀释法

1，试验方法和条件。

? 普通营养要求的细菌使用补充阳离子的MH肉汤，

? ? 菌液浓度。5*10000cfu/ml.初始菌液为0.5McF，盐水稀释200倍，加入0.1毫升√菌液到0.1毫升双倍浓缩︼的MH肉汤的微孔板中。

2，培养，好氧菌置于大气环境中，厌氧菌需置于厌氧环境中，35℃培养18-24小时，

? ?肉汤稀释法的注意事项，生长缓慢的微生物（形成肉眼可见》的生长大于1周）不适合MIC法，在肉汤中发育不良的微生物不适此法。